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酶聯(lián)免疫(HRP)ELISA試劑盒技術(shù)資料
酶聯(lián)免疫(ELISA)通用試劑盒是一種通用的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測抗原或抗體的試劑盒，含有 ELISA 實驗所必須的通用試劑組份，對反應(yīng)條件、操作步驟、各試劑的濃度進行了優(yōu)化，保證了檢測結(jié)果的靈敏度和重復(fù)性。
蛋白檢測酶標試劑盒可用于檢測小鼠、兔或人的抗體。適用于初次接觸 ELISA 技術(shù)的實驗者，或者為節(jié)省時間并保證檢測結(jié)果具有高靈敏和可重復(fù)性的科研工作者。
1.試劑盒組分
1.1. 包被緩沖液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶
1.2. BSA 稀釋液/封閉液(10×濃縮) 100ml ×1 瓶
1.3. 洗滌緩沖液((20×濃縮)100ml ×1 瓶
1.4. TMB 顯色液 100ml ×2 瓶
1.5. 終止液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶
1.6. HRP 標記抗體：1ml
1.6.1 HRP 標記抗人 IgG (H+L) 0.1 mg
1.6.2 HRP 標記抗兔 IgG (H+L) 0.1 mg
1.6.3 HRP 標記抗鼠 IgG (H+L) 0.1 mg
儲存在 2～8°C，有效期 2 年，可以完成 20 塊 96 孔酶標板檢測。
2.試劑盒不提供的試劑或耗材
2.1. 人、小鼠或兔的一抗
2.2. 親和層析純化的未標記捕獲抗體
2.3. 酶標板(不建議用組織培養(yǎng)板)
2.4. 吸水紙、毛巾或棉布
2.5. 蒸餾水或純化水
2.5. 移液器試劑瓶等
2.6. 多通道排槍和加液槽
2.7. 手套
2.8. 槍頭
3.檢測原理
3.1 雜交瘤篩選可以檢測雜交瘤培養(yǎng)液中的特異性抗體，使用適當(dāng)標記二抗，可以檢測抗原特異性的人、鼠和兔抗體。
3.2 檢測抗原或抗體
3.2.1 直接 ELISA：是檢測抗原的簡單方法，包被抗原，加標記的檢測抗體。
3.2.2 間接抗體 ELISA: 可以檢測抗原或抗體，取決于哪種是未知的。包被抗原，加一抗或含抗體的血清或腹水，常用于檢測動物特異性抗體的水平，也可用于檢測雜交瘤培養(yǎng)上清中的單克隆抗體。
3.2.3 雙抗體夾心法：是檢測抗原的一種高度敏感性的方法。用高度純化的抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，檢測抗體可直接標記酶，如果包被抗體和檢測抗體不是來源同種動物，檢測抗體也可不標記，而加針對檢測抗體動物種屬的酶標二抗，此法適用于抗原濃度過低，不能直接包被到酶標板上或者含有未知成分干擾的抗原檢測。
4.確定反應(yīng)條件
4.1 雜交瘤篩選
用間接 ELISA 方法篩選抗體
4.2 檢測抗原或抗體
按照推薦的方法和步驟可以滿足大多數(shù)實驗的要求，反應(yīng)時間、溫度和試劑濃度等可以根據(jù)實驗需要進行調(diào)整每一步都應(yīng)該進行系統(tǒng)性評價以便獲得最佳的實驗條件。試劑通過倍比稀釋以確定最佳濃度。選擇合適的對照，以確定實驗中存在的問題，發(fā)現(xiàn)引起錯誤結(jié)果和高本底的原因。確定實驗方案和樣品數(shù)量后，可以準備所需要的各種材料和試劑。實驗前，建議所有的試劑恢復(fù)到室溫并混勻。4.3 檢測條件概述
4.3.1 包被酶標板
多種包被條件：抗原或抗體濃度、pH、離子強度、溫度和孵育時間都影響包被效率。此外，結(jié)合蛋白的數(shù)量與分子量成反比。試劑盒中包被液為優(yōu)化的磷酸鹽緩沖液，適用于大多數(shù)抗原和抗體的包被。微孔板應(yīng)選擇專用于 ELISA 的酶標板，不建議使用組織培養(yǎng)板。
包被時，抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋后加入到酶標板中室溫孵育，盡可能使用最純的抗原或抗體。一般來說 1～10μg/ml 室溫 1 小時能夠包被飽和。為方便，2～8°C過夜可以到滿意的包被效果。包被后，酶標板用 BSA 稀釋/封閉液封閉 5 分鐘，稀釋/封閉液中含 1%BSA，能夠通過封閉未反應(yīng)部位減少非特異性結(jié)合并保護包被上的蛋白質(zhì)活性。如果暫時不繼續(xù)實驗，可以用塑料膜覆蓋酶標板后冷藏保存，需要時再恢復(fù)室溫繼續(xù)實驗。
4.3.2 洗板
加標本和酶標抗體后需要洗滌，通過洗滌可以去掉未反應(yīng)試劑幫助降低本底。滿意的洗滌方法是孔與孔之見均勻一致并且沒有液體的相互污染。洗滌時將板子翻轉(zhuǎn)并將液體甩掉拍凈。洗滌液中含有 0.05%吐溫-20 以抑制非特異性結(jié)合。如果實驗過程中斷，應(yīng)該將酶標板中加入洗滌液以避免酶標板干燥。
4.3.3HRP 標記抗體
HRP 標記的抗體作為檢測抗體，與底物反應(yīng)后，使底物顯色。實驗過程中避免接觸疊氮na，疊氮na可使 HRP 失活。
4.3.4 底物
使用 TMB 底物，一般來說，產(chǎn)生的顏色與待測物呈正比。
4.3.5 對照和標本
每次實驗都要包含適當(dāng)?shù)膶φ找杂糜诜治鰴z測體系的效能。定量 ELISA 要以標準品進行比較。每次實驗要設(shè)以下對照：
4.3.6 本底對照：不加標本，其它試劑都加，可以幫助分析非特異性本底的原因。將實驗結(jié)果減去本底以保證實驗之間的可比性。
4.3.7 陰性對照：加已知的陰性參考品。
4.3.8 閾值對照：加弱陽性參考品用于確定陽性的臨界值。
4.3.9 陽性對照：加強陽性參考品以確定最大線性信號。
對照和標本都用 BSA 稀釋/封閉液進行稀釋以保證本底，所有實驗最好做雙份。
5.試劑配制
所有試劑當(dāng)日配制
5.1 1X 包被液：用蒸餾水稀釋濃縮洗滌液(1ml 濃縮包被液+9ml 蒸餾水)
注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。
5.2 1X BSA 稀釋/封閉液:
雜交瘤篩選：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(2ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+8ml 蒸餾水)
其它檢測：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(5ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+45ml 蒸餾水)
注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。
5.3 1X 洗滌液：
濃縮洗滌液 20 倍稀釋(15ml 濃縮洗滌液+285ml 蒸餾水)。稀釋的洗滌液室溫穩(wěn)定至少
6 個月。
5.4 二抗工作液：
二抗?jié)饪s液濃度為 0.1mg/ml，2～8°C穩(wěn)定至少 1 年，使用前用 1X BSA 稀釋/封閉液稀釋，對大多數(shù)實驗而言，0.1～2.0μg/ml 工作濃度。
5.5 TMB 顯色液：直接使用。
5.6 終止液：直接使用
5.7 標本：
5.8 對照
6.實驗優(yōu)化
通過 3 個變量來優(yōu)化 ELISA 條件: 試劑濃度、溫度、孵育時間。一般情況下，室溫反應(yīng)對大多數(shù)實驗?zāi)軌虻玫胶芎玫慕Y(jié)果。
優(yōu)化不同試劑濃度和不同孵育時間，選擇最佳的實驗條件。在優(yōu)化最佳濃度時，第一個試劑倍比稀釋，然后第二個試劑倍比稀釋，每一孔都對應(yīng)于第一個試劑和第二個試劑的某一個稀釋度的組合。棋盤滴定確定試劑的最佳濃度
1.加 100μl 稀釋液到 2～12 列的每孔。
2.加 200μl 稀釋的試劑到第一列的每孔中。
3.從第 1 列的孔中取 100μl 轉(zhuǎn)移到第二孔中，混勻用槍吹吸 3～5 次。
4. 重復(fù)步驟 3 向后稀釋，一直到第 11 列，吸取第 11 列 100μl 棄去， 第 12 列作為對照。
重復(fù)以上的操作，從 A 排至 G 排, 稀釋第二個試劑，H 排作為對照。
7.操作步驟
7.1 雜交瘤篩選
包被液：在 1×包被液中稀釋抗原至合適的濃度(一般 1～10μg/ml)。
一抗工作液：含有單克隆抗體的培養(yǎng)液。
二抗工作液：取 25μl 的酶標二抗稀釋到 5.0 ml 1X BSA 的稀釋/封閉液中
7.1.1 包被抗原
1. 加抗原到酶標板中。
2. 室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.1.2 封閉酶標板
1.加 150 uL 1X BSA 稀釋/封閉液到每孔中。
2. 孵育 5-15 分鐘, 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.1.3 與含單克隆抗體的培養(yǎng)液反應(yīng)
1.每孔中加 50 uL 含單克隆抗體的培養(yǎng)液。
2. 室溫反應(yīng) 1 小時.
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.1.4 洗板
1. 加入 1X 洗滌液。
2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
3. 重復(fù) 3～5 次。
7.1.5 加二抗
1. 每孔加 50 uL 二抗。
2. 室溫反應(yīng) 1 小時。e.
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，洗板。
4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.1.6 顯色反應(yīng)
1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。
2. 每孔加 50ul 終止液。
3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。
7.2 直接 ELISA
抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。
酶標抗體：稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。
7.2.1 加抗原
1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗原包被液。
2.室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.2.2 封閉
1. 每孔加 300μ1X BSA 稀釋/封閉液。
2. 反應(yīng) 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.2.3 加酶標抗體
1. 每孔加入 100 μl 酶標抗體。
2. 室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.2.4 洗板
1. 加入 1X 洗滌液。
2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
3. 重復(fù) 3～5 次。
4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.2.5 顯色反應(yīng)
1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。
2. 每孔加 50ul 終止液。
3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。
7.3 間接抗體 ELISA
抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。
一抗/二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。
7.3.1 加抗原
1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗原包被液。
2.室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.3.2 封閉
1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。
2. 反應(yīng) 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.3.3 加一抗
1. 每孔中加入 100μl 一抗
2. 室溫反應(yīng) 1 小時
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.3.4 洗板
1. 加入 1X 洗滌液。
2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
3. 重復(fù) 3～5 次。
7.3.5 加二抗
1. 每孔加入 100μl 酶標二抗。
2. 室溫孵育 1 小時。
3. 重復(fù) 3～5 次。
4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.3.6 顯色反應(yīng)
1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。
2. 每孔加 100ul 終止液。
3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。
7.4 雙抗體夾心 ELISA
包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。
抗原標本：將抗原標本稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中。
二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。
7.4.1 加捕獲抗體
1. 在酶標板中每孔加入 100μ抗體包被液。
2.室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.4.2 封閉
1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。
2. 反應(yīng) 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.4.3 加抗原
1. 每孔中加入 100μl 標本液
2. 室溫反應(yīng) 1 小時直至過夜。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.4.4 洗板
1. 加入 1X 洗滌液。
2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
3. 重復(fù) 3～5 次。
7.4.5 加標記抗體1. 每孔加入 100μl 標記。
2. 室溫孵育 1 小時。
3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。
4. 重復(fù) 3～5 次。
5. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。
7.4.6 顯色反應(yīng)
1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。
2. 每孔加 100ul 終止液。
3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。
8.可能出現(xiàn)的問題和解決辦法
8.1 以下結(jié)果表示實驗有效：
陰性對照：無色
背景對照：OD 值低于 0.2
閾值對照：中度顯色
強陽性對照：深度顯色，OD≥1.0
8.2 希望增加特異性信號
1. 增加酶標抗體的濃度或延長孵育時間或提高孵育溫度。
2. 延長底物的孵育時間。
3. 增加包被抗原濃度或延長孵育時間。
4.用純化的抗原。
5. 封閉時間縮短或增加 BSA 稀釋/封閉液的稀釋度。
6. 減少洗板次數(shù)或操作更輕柔。
8.3 減少非特異性信號
1.減少包被抗原濃度或縮短孵育時間。
2.減少酶標抗體的濃度或縮短孵育時間或降低孵育溫度。
3.縮短底物的孵育時間。
4.增加洗板次數(shù)或延長洗滌液浸泡時間。
5.通過加低濃度包被抗原或捕獲抗體到稀釋的酶標物中以減少結(jié)合物的交叉反應(yīng)。
8.4. 背景忽高忽低，檢查洗板機功能是否正常。
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