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實驗干貨——PCR試劑盒注意事項與原則
更新時間:2023-04-04瀏覽:685次

  實驗干貨——PCR試劑盒注意事項與原則


  PCR試劑盒注意事項:

 ?、偌尤朐噭┑捻樞颍员WC所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

 ?、谑褂酶蓛舻乃芰先萜髋渲孟礈煲?。

  ③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

 ?、艿孜顰應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

 ?、菹礈?strong>酶標板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。

  ⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器 。

 ?、邔嶒炛胁挥玫陌鍡l應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。

 ?、嘣噭?yīng)按標簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄,不可保存。

  ⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

  PCR試劑盒原則:

 ?、僖镩L度: 15-30bp,常用為20bp左右。

 ?、谝飻U增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

  ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

 ?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

 ?、菀?'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

  ⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

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