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本生快訊:血液樣本的收集與保存方法
全血根據(jù)收集的條件,分成不抗凝和抗凝兩種。同時(shí),不抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血清;抗凝分離出的上層黃色的液體我們稱之為血漿。
標(biāo)本的存放溫度及時(shí)間,血清、血漿及細(xì)胞分離的方法步驟也是分析前影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素。抽血后,血細(xì)胞因代謝需要,要消耗掉部分營養(yǎng)成分,故對(duì)這些成分進(jìn)行測(cè)定時(shí),需及時(shí)地離心以分離掉細(xì)胞成分。
采血前個(gè)體的準(zhǔn)備情況,如空腹時(shí)間的長短、采樣時(shí)間的確定及采血時(shí)患者的姿勢(shì);止血帶應(yīng)用時(shí)間,輸液情況,體育運(yùn)動(dòng),抗凝劑及穩(wěn)定劑的選用;標(biāo)本的處理等均可影響到某些檢驗(yàn)指標(biāo)的水平。故標(biāo)本采集過程應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化,以最大限度地減少分析前誤差。
一、不抗凝收集血清:
1、無添加劑的干燥空管收集:
血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的藥劑(硅油)。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固,等血清自然析出后,離心使用。主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(zhì)(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測(cè)、艾滋病檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)檢測(cè)。
亦可直接用干燥EP管收集全血,充分靜置使得紅細(xì)胞充分自然凝固后,離心分離出血清待用或保存。
2、用促凝管收集:
采血管內(nèi)壁均勻涂有防止掛壁的硅油,同時(shí)添加了促凝劑。促凝劑能激活纖維蛋白酶,使可溶性纖維蛋白變成不可溶性的纖維蛋白聚體,進(jìn)而形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊,如果想快點(diǎn)出結(jié)果時(shí),可采用促凝管。一般靜置半小時(shí)到1小時(shí),直接離心分離出血清待用或保存,常用于急診生化。
3、含有分離膠及促凝劑的采血管收集:
管壁經(jīng)過硅化處理,并涂有促凝劑可加速血液的凝固,縮短檢驗(yàn)時(shí)間。管內(nèi)加有分離膠,分離膠與PET管具有很好的親和性,確實(shí)起到隔離作用,一般即使在普通離心機(jī)上,分離膠能將血液中的液體成分(血清)和固體成分(血細(xì)胞)分開并積聚在試管中形成屏障。離心后血清中不產(chǎn)生油滴,主要用于血清生化(肝功、腎功、心肌酶、淀粉酶等)、電解質(zhì)(血清鉀、鈉、氯、鈣、磷等)、甲狀腺功能、藥物檢測(cè)、艾滋病檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物、血清免疫學(xué)。
促凝管的優(yōu)點(diǎn):
?、佟⒓铀偌t細(xì)胞的凝固,無需長時(shí)間的靜置;
②、帶有分離膠,有效的將血清分離出來,更好的避免溶血;
收集血清的缺點(diǎn):
?、?、需要紅細(xì)胞的充分凝固,所需靜置時(shí)間較長;
?、凇⒎蛛x出的血清相對(duì)較少,1ml全血不抗凝約只能分離出0.2-0.3ml血清。
二、抗凝收集血漿:
收集抗凝全血,輕輕顛倒充分抗凝后,可直接離心分離血漿待用或保存。根據(jù)不同抗凝劑的性能特征,選擇合適的抗凝劑。實(shí)驗(yàn)室常用的抗凝劑有肝素的各種鹽、EDTA及枸櫞酸鈉。
1、肝素抗凝:
常用的抗凝劑,一般情況下對(duì)相關(guān)指標(biāo)都不會(huì)有干擾,同時(shí)抗凝比例較大(抗凝劑:
全血=1:30),對(duì)血液基本沒有稀釋影響。
肝素是一種含有硫酸基團(tuán)的粘多糖,帶有強(qiáng)大的負(fù)電荷,具有加強(qiáng)抗凝血酶III滅活絲
氨酸蛋白酶的作用,從而阻止凝血酶的形成,并有阻止血小板聚集等多種抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流變的檢測(cè),是電解質(zhì)檢測(cè)的選擇,檢驗(yàn)血標(biāo)本中的鈉離子時(shí),不能使用肝素鈉,以免影響檢測(cè)結(jié)果。也不能用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類,因肝素會(huì)引起白細(xì)胞聚集。
盡管用肝素的三種鹽抗凝所得電解質(zhì)濃度無顯著差別,但肝素鋰還是被認(rèn)為是好的。這主要是人們認(rèn)為肝素鈉可使鈉的測(cè)定值偏高,肝素銨可使血氨測(cè)定值偏高(尿素酶法測(cè)定)。
肝素可抑制分子生物學(xué)中常用的一些工具酶,如限制性內(nèi)切酶、Taq酶等,可影響PCR
的實(shí)驗(yàn)結(jié)果??刹捎靡恍┓椒ㄏ嗡氐囊种菩?yīng),如利用肝素酶,或在分離白細(xì)胞后用緩沖液洗滌白細(xì)胞兩次以上等。然而,許多實(shí)驗(yàn)工作者仍不愿意在進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用肝素作抗凝劑。
2、EDTA抗凝:
乙二胺四乙酸是一種氨基多羧基酸,可以有效地鰲合血液中的鈣離子,鰲合鈣會(huì)將鈣從
反應(yīng)點(diǎn)移走將阻止和終止內(nèi)源性或外源性凝血過程,從而防止血液凝固,與其他抗凝劑比較而言,其對(duì)血球的凝集及血細(xì)胞的形態(tài)影響較小,故通常使用EDTA鹽(2K、3K、2Na)作為抗凝劑。用于一般血液學(xué)檢查,不能用于血凝、微量元素及PCR檢查。
由于EDTA會(huì)螯合重金屬離子,用該抗凝劑的話,部分帶有金屬離子的大分子酶都會(huì)有大量損失,具體看客戶測(cè)定的指標(biāo)來選擇,做血常規(guī)的話必須用EDTA抗凝。
3、枸櫞酸鹽抗凝:
檸檬酸鈉通過作用于血樣中鈣離子鰲合而起抗凝作用,國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦為3.2%或3.8%,抗凝劑與血比例為1:9,主要用于纖溶系統(tǒng)(凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間、活化部分凝血酶時(shí)間、纖維蛋白原)。采血時(shí)應(yīng)注意采足血量,以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,采血后應(yīng)立即輕輕顛倒混勻5-8次。由于抗凝比例較小(抗凝劑:全血=1:9),對(duì)血液有一定的稀釋,一般不建議。
選擇抗凝的注意點(diǎn):
?、佟⒚恳环輼颖舅拥目鼓齽┑牧恳恢?,同時(shí)所取的全血的量也要盡量一致;
?、凇⑹占鼓笠欢ㄒp輕顛倒,充分抗凝,防止部分血液未接觸到抗凝劑而導(dǎo)致凝固;
?、邸⒖鼓占难獫{相對(duì)較多(1ml抗凝全血能分離出0.4-0.5ml血漿);
?、堋⒖鼓占难獫{冷凍保存后,解凍時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀渾濁,如有則需要離心去掉渾濁后
用于測(cè)定。
血清、血漿收集好后,暫時(shí)不測(cè)定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中間如凍融,-20℃以下可保存一個(gè)月,-70℃以下可保存三個(gè)月。
三、收集血清、血漿所用離心轉(zhuǎn)速:
分離血清或血漿,根據(jù)種屬不同,離心轉(zhuǎn)速也有差異,推薦離心轉(zhuǎn)速為:
①、小鼠:一般1000-1500轉(zhuǎn)/分,離心8-10分鐘;
?、凇⒋笫?、兔子:一般2000-2500轉(zhuǎn)/分,離心8-10分鐘;
?、邸⑷耍阂话?500-3000轉(zhuǎn)/分,離心8-10分鐘。
四、高脂及溶血因素的影響:
溶血的影響:
溶血對(duì)某些檢驗(yàn)指標(biāo)的的影響不僅取決于所采用的方法,也取決于所用的分析儀器。采用雙波長測(cè)定法可在一定程度上消除Hb的顏色干擾,然而Hb的干擾并不能消除,尤其是當(dāng)Hb可以與采用的試劑發(fā)生作用時(shí)??偟膩碚f,輕微的溶血,對(duì)大多數(shù)臨床化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定方法無明顯干擾。嚴(yán)重的溶血,可能有兩方面的影響:(1)測(cè)定成分在紅細(xì)胞內(nèi)的濃度高于血漿時(shí),導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高;(2)測(cè)定成分在RBC內(nèi)濃度低于血漿時(shí),產(chǎn)生輕微的稀釋效應(yīng)。
用肉眼觀察標(biāo)本是否溶血只能是粗略的判斷。只有當(dāng)血清中血紅蛋白濃度超過20mg/dl時(shí),
肉眼才能見到溶血情況。有人報(bào)導(dǎo)0.1%的紅細(xì)胞發(fā)生溶血后,其血清外觀與非溶血標(biāo)本一致;
1%紅細(xì)胞發(fā)生溶血后,血清清亮,呈櫻紅色,這樣的標(biāo)本就代表了中度溶血。
有人建議用血清Hb濃度來對(duì)溶血程度進(jìn)行判斷。非溶血標(biāo)本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dl,中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dl。即使輕微的溶血也可能導(dǎo)致相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果偏高(如LDH、ACP、K等),這樣的標(biāo)本應(yīng)盡量避免使用。
高脂的影響:
高脂血癥所產(chǎn)生的混濁對(duì)某些指標(biāo)測(cè)定的影響,同樣取決于所采用的測(cè)定方法。一般而言,脂血通過樣品不均一性、水置換、親脂成分的吸收而影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。肉眼可見的脂血標(biāo)本可影響總蛋白的測(cè)定、電泳及色譜分析等。
五、全血或紅細(xì)胞的收集及保存
測(cè)定全血或者是紅細(xì)胞中相關(guān)指標(biāo)的話,首先需要收集抗凝全血。
全血:收集抗凝全血,輕輕顛倒充分抗凝后,可直接定量吸取全血,用冷蒸餾水制備溶血液后用于不同指標(biāo)的檢測(cè);也可定量吸取全血,轉(zhuǎn)入EP管,低溫凍存(溫度越低越好),測(cè)定之前解凍并按比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測(cè)。
紅細(xì)胞:收集抗凝全血,輕輕顛倒充分抗凝后,直接離心吸走血漿,留下層紅細(xì)胞,加入3倍體積的生理鹽水,輕輕顛倒混勻,500~1000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,棄上清留沉淀紅細(xì)胞,重復(fù)2~3次,至上清液無色為止(洗滌紅細(xì)胞)。
①、直接定量吸取紅細(xì)胞,按比例加入冷蒸餾水制成溶血液待測(cè);
?、凇⒍课〖t細(xì)胞,轉(zhuǎn)入EP管,立即低溫凍存(溫度越低越好),測(cè)定之前解凍,并按比例加入冷蒸餾水制成溶血液用于檢測(cè)(解凍后部分紅細(xì)胞會(huì)破裂,因此樣本冷凍保存之前必須進(jìn)行定量)。
溶血液的制備:定量吸取紅細(xì)胞或者全血,按比例加入冷蒸餾水,充分漩渦混勻制備溶血液(對(duì)光觀察,溶液澄清透亮,可顯微鏡觀察紅細(xì)胞是否破裂,如未破可延長混勻時(shí)間),稀釋成不同濃度用于不同指標(biāo)的檢測(cè)。
試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場(chǎng),較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。
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