聯(lián)系電話:
18502669006
貼壁細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析及解決方法!
貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)(瓶)器皿壁上,細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展,然后開始有絲分裂,并很快進(jìn)入對數(shù)生。貼壁細(xì)胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣,所以培養(yǎng)時更容易出現(xiàn)問題。BUNSEN本生小編總結(jié)了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見問題,并詳細(xì)介紹原因和解決方法,若培養(yǎng)時遇到這些情況,可參考對應(yīng)解決方法處理。
一、貼壁細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞不貼壁
常見原因:胰蛋白酶消化過度;支原體污染;培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解);細(xì)胞老化;接種細(xì)胞起始濃度太低或太高。
解決方法:縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度;分離培養(yǎng)物,檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物;使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2;啟用新的保種細(xì)胞;調(diào)節(jié)接種細(xì)胞濃度。
二、培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢
常見原因:由于更換不同培養(yǎng)液或血清;培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必須成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞;培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染;試劑保存不當(dāng);接種細(xì)胞起始濃度太低;細(xì)胞已老化;支原體污染。
解決方法:比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗,讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液;換入新鮮配置培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子;用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物;血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存,需在1周內(nèi)用完;增加接種細(xì)胞起始濃度;換用新的保種細(xì)胞;分離培養(yǎng)物,檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。
三、細(xì)胞生長周期變慢,邊養(yǎng)邊漂
常見原因及解決方法:
1、細(xì)胞傳代時密度太稀或太密:建議細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代,傳代密度適中,密度過低會延長生長周期;
2、傳代操作不當(dāng):根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時間,一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化,難消化的細(xì)胞可分次消化,每次時間不超過5min;頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差,常規(guī)換液時間間隔為2~3天。
四、傳代后部分細(xì)胞漂浮
常見原因及解決方法:
1、傳代細(xì)胞密度太大:一般細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時可進(jìn)行傳代操作,傳代密度需適中,傳代密度過高也會導(dǎo)致傳代后漂浮;
2、細(xì)胞狀態(tài)不好:可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善;
3、吹打次數(shù)過多造成機(jī)械損傷:輕柔吹打,細(xì)胞呈單顆粒時可停止吹打,吹打過程避免氣泡產(chǎn)生;
4、培養(yǎng)基更換后不適應(yīng):更換回原來的培養(yǎng)基;或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用,使細(xì)胞有個適應(yīng)期。
五、傳代后細(xì)胞全部飄起
解決方法:檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色,檢查瓶蓋是否透氣,不透氣瓶蓋是否被擰松。
通常培養(yǎng)基偏堿,顏色就會偏紫,主要是因為培養(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫,培養(yǎng)基量太少,或培養(yǎng)基存放時間太長時都會變堿。建議配好培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完,量少時放到15mL離心管里保存。
六、傳代后細(xì)胞成團(tuán)
解決方法:
1、低密度接種,延長換液時間,防止細(xì)胞脫落;
2、使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿,以增加細(xì)胞貼壁牢固度,降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率;
3、重新鋪板,并更換新配制的培養(yǎng)基,加大血清比例(增加比例不超過5%);
4、接種時,減少培養(yǎng)基量(如T25加3mL)以加快細(xì)胞貼壁速度,等待細(xì)胞貼壁后(約8-12小時),再補(bǔ)加培養(yǎng)基到正常用量。
七、傳代后細(xì)胞變形
原因及解決方法如下
1)變形,但細(xì)胞還在生長:可能是血清批次不一樣導(dǎo)致,血清成分復(fù)雜,不同批次和品牌間均存在成分差異,影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清,更換血清時需與原血清比例混合后使用,使細(xì)胞有過渡期;
2)變形,但細(xì)胞不長,且碎片增多:可能傳代操作過程損傷,常見于消化不當(dāng),或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài);消化時間根據(jù)每個細(xì)胞的狀態(tài)來調(diào)整,消化過度或者消化不充分均會對細(xì)胞造成影響;培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,實驗環(huán)境盡量潔凈,確保細(xì)胞無外源污染。
注:僅供參考,如有如有侵權(quán)或不愿小編轉(zhuǎn)載發(fā)布請聯(lián)系刪除,謝謝!
本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。
技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) 管理登陸 網(wǎng)站地圖