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人活性氧 (ROS) 酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

  本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：0.3ng/mL - 8ng/mL

  規(guī)格：96T  貨號：BS-9689-A

使用目的：

本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中活性氧 (ROS) 含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人活性氧(ROS)水平。用純化的人活性氧(ROS) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入活性氧 (ROS)，再與 HRP  標(biāo)記的活性氧 (ROS) 抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的活性氧 (ROS) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度 (OD  值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人活性氧 (ROS) 濃度。

試劑盒組成：

標(biāo)本要求：

1 ．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能 馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的 (HRP) 活性。

操作步驟：

1.     標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀 釋。

2.     加樣：分別設(shè)空白孔 (空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、 待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，

然后再加待測樣品 10μl  (樣品最終稀釋度為 5 倍) 。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.     溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.     配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用5.     洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復(fù)

5 次，拍干。

6.     加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl ，空白孔除外。

7.     溫育：操作同 3。

8.     洗滌：操作同 5。

9.     顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl ，再加入顯色劑 B50μl ，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘.

10.   終止：每孔加終止液 50μl ，終止反應(yīng) (此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

11.   測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 (OD 值) 。  測定應(yīng)在加終止

液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

操作程序總結(jié)：

計算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1 ．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

    2 ．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3 ．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4 ．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高 (樣本 OD 值 大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD 值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù) (n 倍) 后再測定，計 算時請最后乘以總稀釋倍數(shù) ( ×n×5)。

   5 ．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

   6 ．底物請避光保存。

  7 ．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

  8 ．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

   9 ．本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期

1 ．試劑盒保存：；2-8℃。

2 ．有效期：6 個月

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