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Elisa實驗| 雙抗體夾心法ELISA實驗操作
更新時間:2023-09-22瀏覽:777次

  Elisa實驗| 雙抗體夾心法ELISA實驗操作


  一、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋及樣品準(zhǔn)備

  樣本離心4℃,1000Xg,5min

  標(biāo)準(zhǔn)品離心4℃,10000Xg,1min

  1mL稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品,靜置1-2min,取7支空EP管,每管加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液,靜置后標(biāo)準(zhǔn)品混勻,將液體離心至底部(800Xg,1min)

  取同體積標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋,渦旋混勻,依次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,最后一管為空白

  二、酶標(biāo)板拆分

  可按照實驗需求拆裝板條,讓板條松動并輕推底部,拆下板條防止在備用板框上,剩余板條防至鋁箔袋,封口存放。

  三、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本點樣

  由低到高濃度,每孔100μL,懸空加入(建議均設(shè)置復(fù)孔)

  處理后樣品取上清溶液,懸空,每孔100μL,腹膜后標(biāo)記。提前預(yù)熱,注意溫度,37℃孵育90min。


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  四、生物s化抗體工作液制備

  取適量生物素化抗體稀釋液,加入濃縮液,稀釋100倍后,顛倒混勻20次,待用。

  取出酶標(biāo)板,勿觸摸板條底部,甩盡孔內(nèi)液體后,拍干。將工作液倒入加樣槽,懸空垂直加入,100μL/孔,腹膜后標(biāo)記,37℃孵育60min。

  五、1x洗液配制

  根據(jù)需求取雙蒸水適量,取25x濃縮洗滌液適量,加入燒杯,磁力攪拌器混勻5-10min。

  六、濃縮HRP酶結(jié)合物工作液制備

  取適量HRP酶結(jié)合物稀釋液,加入濃縮液,稀釋100倍后,顛倒混勻20次,備用

  取出酶標(biāo)板,勿觸摸板條底部。輕撕覆膜,避免液體濺出。參數(shù)設(shè)定:洗滌次數(shù)3次、洗板條數(shù)12條、洗滌液量350μL/孔、震板5s。拍干液體,更換吸水紙。將工作液倒入加樣槽,懸空垂直加入,100μL/孔,腹膜后標(biāo)記,37℃孵育30min。

  七、顯色

  平衡取出酶標(biāo)板勿觸摸板條底部,輕撕覆膜,避免液體濺出,參數(shù)設(shè)定。洗滌次數(shù)5從,洗板條數(shù)12條,洗滌液量350μL/孔,震板5s。拍干液體,更換吸水紙。

  將底物溶液倒入加樣槽,懸空垂直加入,90μL/孔,腹膜后標(biāo)記,37℃孵育15-30min。

  八、終止反應(yīng)

  平衡取出酶標(biāo)板,切勿觸摸板條底部,顯色后前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色剃度。輕撕覆膜,避免液體濺出。懸空垂直加入,50μL/孔,加入終止液時可看到藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色。

  九、數(shù)據(jù)處理

  輕輕擦拭板底,放入酶標(biāo)儀中,上機操作。

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