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人核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒實驗使用說明書
發(fā)布時間:2024/10/25瀏覽:111次

  人核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒實驗使用說明書 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo),本生,您信任的合作伙伴!本生試劑盒

  檢測原理

  試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被核因子κB受體活化因子配基(RANKL)抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核因子κB受體活化因子配基(RANKL)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。

  樣品收集、處理及保存方法

  1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

  2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

  3. 細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

  4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

  5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

  自備物品

  酶標(biāo)儀(450nm)

  高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

  37℃恒溫箱

  操作注意事項

  試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。

  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

  濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍,最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

  所有液體組分使用前充分搖勻。

  試劑盒組成名稱96孔配置48孔配置備注

  微孔酶標(biāo)板12孔×8條12孔×4條無

  標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6管0.3mL*6管無

  樣本稀釋液6mL3mL無

  檢測抗體-HRP10mL5mL無

  20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋

  底物A6mL3mL無

  底物B6mL3mL無

  終止液6mL3mL無

  封板膜2張2張無

  說明書1份1份無

  自封袋1個1個無

  注:標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為:0、50、100、200、400、800 pg/mL

  試劑的準(zhǔn)備

  20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

  洗板方法

  手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。

  自動洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

  操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;

  樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

  除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

  每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

  結(jié)果判斷

  繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

  


  試劑盒性能

  準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。

  靈敏度:檢測濃度小于1.0 pg/mL。

  特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

  重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

  有效期:6個月



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