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　　本生小課堂：小分子ELISA試劑盒的標曲制作

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夾心法的兩個或兩個以上的不同位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可采用競爭ELISA法模式。檢測原理是待測樣本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。樣本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等的ELISA測定多用競爭法。

　　實例講述

　　嘔吐毒素(DON)是其中最重要一種毒素，主要來自鐮刀菌屬，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素(vomitoxin，VT)。DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人畜攝入被DON污染的食物、飼料后，會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。HPLC等檢測方法前處理步驟繁瑣且費用昂貴，ELISA方法具有靈敏度高，特異性強，樣品前處理相對簡單等特點，可經(jīng)濟、快速地檢測大量樣品。

　　檢測原理

　　自主研發(fā)的嘔吐毒素(DON)ELISA試劑盒采用間接競爭ELISA方法。首先將嘔吐毒素抗原結(jié)合到酶標板微孔條上，實驗時樣品或標準品的嘔吐毒素與包被的嘔吐毒素抗原競爭生物素標記的抗嘔吐毒素單抗上的結(jié)合位點，游離的成分被洗去。加入辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，嘔吐毒素濃度與OD450值之間呈反比，樣本吸光值與其含有的嘔吐毒素成負相關(guān)。

　　數(shù)據(jù)分析

　　競爭ELISA法的結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第一種定性分析方法，而定量判定用第二種方法。競爭ELISA法的標曲制作和濃度計算與雙抗體夾心法ELISA試劑盒明顯不同，具體詳細說明如下：

　　定性分析

　　用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.527，樣本2的吸光度值為1.225，標準品吸光度值分別是：0ppb為2.044;5 ppb為1.758;15 ppb為1.368;45 ppb為0.783;135 ppb為0.287;405 ppb為0.092。則樣本1的濃度范圍是45ppb～135 ppb;樣本2的濃度范圍是15 ppb～45 ppb，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中嘔吐毒素的濃度范圍。

　　定量分析

　　1、百分吸光率的計算

　　標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即

　　B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

　　標準曲線的繪制與計算

　　以標準品百分吸光率為縱坐標，以嘔吐毒素(ppb)的對數(shù)為橫坐標，【注意：標準曲線OD值范圍需處于0-3之間;標準曲線呈現(xiàn)出直線或類似直線形式，以增加標準曲線函數(shù)計算的擬合度，有利于提高樣本濃度測量準確性】。本試劑盒中以嘔吐毒素(ppb)的半對數(shù)為橫坐標，是依據(jù)標準液濃度分別是：0ppb;5 ppb;15 ppb;45 ppb;135 ppb;405 ppb，5 ppb-405 ppb濃度間呈現(xiàn)出后一濃度為前一濃度的3倍，進行對數(shù)計算

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