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本生闡述:小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1 ELISA試劑盒技術(shù)資料
更新時(shí)間:2023-06-05瀏覽:1301次

  本生闡述:小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1 ELISA試劑盒技術(shù)資料


  適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

  介紹:

  轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的 TGF-β超家族。這一家族除 TGF-β1 至TGF-β5 外,還有活化素、抑制素、繆勒氏管抑制物質(zhì)(MIS)和骨形成蛋白(BMPs)(1)。TGF-β是根據(jù)這種細(xì)胞因子能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化命名的。TGF-β1 的生物學(xué)功能主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面,TGF-β對(duì)細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。

  檢測原理:

  ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將

  抗小鼠 TGF-β1 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本,標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TGF-β1 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗小鼠 TGF-β1 抗體,該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TGF-β1發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素,生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物 TMB,若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 TGF-β1,則 HRP 會(huì)使無色 TMB 變成不同深淺(正相關(guān))的藍(lán)色物質(zhì),加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色;最后,在λmax=450 nm(OD=450 nm)處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD),樣本中的小鼠 TGF-β1 濃度與 OD 成正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠 TGF-β1 的濃度。

  注意事項(xiàng):

  1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,請(qǐng)不要使用過期的試劑。

  2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品,請(qǐng)丟棄。

  3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min,且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

  4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測,且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

  5. 為避免交叉污染,請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管,槍頭,封板膜(※)及潔凈塑料容器。

  6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上,使用前請(qǐng)離心處理(5-10 S 即可),使管壁上的液體集中在管底部,取用時(shí),請(qǐng)用移液器小心吹打幾次。

  7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,請(qǐng)不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。

  8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

  安全提示:

  試劑盒中的終止液為酸性溶液,操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù);在操

  作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛,如果不慎接觸,請(qǐng)用大量清水清洗;檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí),請(qǐng)按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

  試劑盒組成及儲(chǔ)存:

  1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 ;

  2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶

  3 酶標(biāo)包被板 12 孔×8 條 ;

  4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

  5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 ;

  6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶

  7 終止液 6ml×1 瓶;

  8 標(biāo)準(zhǔn)品(48ng/ml) 0.5ml×1 瓶

  9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶;

  10 說明書 1 份

  11 封板膜 2 張; 12 密封袋 1 個(gè)

  自備實(shí)驗(yàn)器材(不提供,可代購)

  1. 酶標(biāo)儀(主波長 450nm,參考波長 630nm)

  2. 高精度移液器及一次性吸頭:0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

  3. 洗板機(jī)或洗瓶

  4. 37℃孵育箱

  5. 雙蒸水,去離子水,量筒等

  6. 稀釋用聚丙烯試管

  樣本收集及儲(chǔ)存:

  1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:

  將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。

  2. 血清樣本:

  室溫血液自然凝固 20 min 后,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),保存過程中如有沉淀,請(qǐng)?jiān)俅坞x心,避免反復(fù)凍融。

  3. 血漿樣本:

  將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合 20 min,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存),避免反復(fù)凍融。

  注意:血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,以免影響檢測結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值,請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

  試劑準(zhǔn)備:

  1. 試劑回溫:首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒,待測樣本放置于室溫下,濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,請(qǐng)放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

  2. 配制洗滌液:預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積,然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液,未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

  3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋:加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml),然后按照以下濃度:1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 15.62 pg/ml進(jìn)行2倍梯度稀釋。1000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn),0pg/ml(即只添加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1))為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(2000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(1000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,并將其貯存在-20~-80℃冰箱,具體如下圖。

  4. 生物素化抗體工作液:預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量,用檢測稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前充分混勻),請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

  5. 酶結(jié)合物工作液:按每次試驗(yàn)所需用量配制,用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前離心),請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

  6. 標(biāo)本預(yù)處理:

  血清或血漿標(biāo)本激活方法:

  1). 在225μl標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)中,加入5μl血清或血漿標(biāo)本。

  2). 加10μl 1 N HCl,蓋緊,上下混勻。2-8℃放置60±2分鐘。

  3). 加10μl 1 N NaOH,蓋緊,上下混勻。(總體積250μl即50倍稀釋)

  4). 即用,或置-20/-70℃可保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

  (注意:不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異,請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度)

  細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本激活方法:

  1). 在80μl標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)中,加入100μl標(biāo)本。

  2). 加10μl 1N HCl,蓋緊,上下混勻。2-8℃放置60±2分鐘. 3). 加10μl 1N NaOH,蓋緊,上下混勻。(總體積200μl即2倍稀釋)。

  4). 即用,或置-20/-70℃可保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。. (注意:不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異,請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度)

  7. 洗滌方法:

  自動(dòng)洗板:甩盡酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭吸水紙上拍干,注入洗滌液為 300ul/

  孔,注與吸出間隔為 30 秒,洗板 5 次。

  手工洗板:甩盡酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭吸水紙上拍干,用洗瓶加入洗滌液

  300ul/孔,靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體,在厚迭的吸水紙上拍干,洗板 5 次。

  結(jié)果判斷:

  1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測,參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測,請(qǐng)用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

  2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值:每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。

  3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度OD值為縱坐標(biāo),用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品中TGF-β1含量可通過對(duì)應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

  4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

  2. 靈敏度:

  可檢測小鼠 TGF-β1 濃度達(dá) 8pg/ml,

  20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。

  3. 特異性:

  不與小鼠 TGF-β RI/Fc Chimera 反應(yīng),人的 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 等反應(yīng)

  4. 重復(fù)性:

  板內(nèi),板間變異系數(shù)<10%

  5. 回收率:

  在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的小鼠 TGF-β1,計(jì)算回收率。

  6. 線性稀釋:

  分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 TGF-β1,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋,評(píng)估線性。

  小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1 ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。


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